A revisão por pares externos do teste RT-PCR para a detecção de SARS-CoV-2 revela 10 deficiências científicas essenciais a nível molecular e metodológico: Consequências para resultados falsos positivos.

Caro leitor, hoje começaremos com uma citação do Prof. Albert Einstein, (de uma transmissão de rádio para United Jewish Appeal, 11 de abril de 1943):

"A busca da verdade e do conhecimento é uma das coisas mais belas de que uma pessoa é capaz, mesmo que o orgulho dessa busca esteja principalmente nos lábios daqueles que menos se dedicam a essas buscas."

O mundo está com o por quase um ano Pandemia de corona empregado. Muitas medidas foram tomadas para controlar a situação. Nós, da equipe do DTT Science-Tank, nunca abordamos o tópico da pandemia corona. A razão é bastante simples. Para formar uma opinião científica sobre um assunto, é necessária uma disputa saudável e respeitosa, principalmente no campo da ciência. Bons cientistas sempre fizeram isso. Se você apenas olhar para a história da física quântica e as várias rixas lendárias entre cientistas, você aprenderá como a ciência funciona. Infelizmente aconteceu no presente Crise de Corona mal farto de uma disputa adequada, até agora.

Nem é preciso dizer que a base para várias medidas dos governos é o Testes de PCR representam.

O trabalho publicado no início de 2019: Detecção de novo coronavírus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real - para ser encontrado aqui (https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045)

Autores:

Victor M Corman, Olfert Landt, Marco Kaiser, Richard Molenkamp4, Adam Meijer, Daniel KW Chu6, Tobias Bleicker1, Sebastian Brünink, Julia Schneider, Marie Luisa Schmidt1, Daphne GJC Mulders4, Bart L Haagmans, Bas van der Veer, Sharon van den Brink , Lisa Wijsman, Gabriel Goderski, Jean-Louis Romette, Joanna Ellis, Maria Zambon, Malik Peiris, Herman Goossens, Chantal Reusken, Marion PG Koopmans, Christian Drosten   

é conhecido. Foi e talvez ainda seja considerado o principal gatilho para a implementação de Testes de PCR.

Sem entrar em detalhes do trabalho, gostaríamos de entrar em um Relatório de revisão para chamar a atenção:

Fonte da imagem: Pixabay

A revisão por pares externos do teste RTPCR para detectar SARS-CoV-2 revela 10 grandes falhas científicas a nível molecular e metodológico: consequências para resultados falsos positivos - para ser encontrado aqui (https://cormandrostenreview.com/report/)      

autores:

Pieter Borger, Bobby Rajesh Malhotra, Michael Yeadon, Clare Crai, Kevin McKernan, Klaus Steger, Paul McSheehy, Lidiya Angelova, Fabio Franchi, Thomas Binder, Henrik Ullrich, Makoto Ohashi, Stefano Scoglio, Marjolein Doesburg-van Kleffens, Rainer Klement, Ruth Schruefer, Berber W. Pieksma, Jan Bonte, Bruno H. Dalle Carbonare, Kevin P. Corbett, Ulrike Kämmerer             

      
O artigo é uma tradução dos principais pontos da revisão para o alemão: Fonte (https://cormandrostenreview.com/report/):

A revisão por pares externos do teste RT-PCR para a detecção de SARS-CoV-2 revela 10 deficiências científicas essenciais a nível molecular e metodológico: Consequências para resultados falsos positivos.

Na publicação intitulada "Detecção de novo coronavírus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real"(Eurosurveillance 25 (8) 2020), os autores fornecem um fluxo de trabalho de diagnóstico e protocolo RT-qPCR para a detecção e diagnóstico de 2019-nCoV (agora conhecido como SARS-CoV2) que afirmam ser validado e fornece uma metodologia de diagnóstico robusta para uso em laboratórios de saúde pública. Em vista das consequências desta publicação para sociedades em todo o mundo, um grupo de pesquisadores independentes realizou uma revisão ponto a ponto da publicação acima na qual

1) todos os componentes do projeto de teste apresentado foram verificados,

2) o Recomendações do protocolo RT-qPCR foram avaliados quanto às boas práticas de laboratório

e

3) os parâmetros foram examinados com base na literatura científica relevante na área.

Que publicou Protocolo RT-qPCR para a detecção e diagnóstico de 2019-nCoV e o manuscrito tem vários erros técnicos e científicos, incluindo um design de primer inadequado, um problemático e inadequado Protocolo RT-qPCR e a falta de um exato Validação de teste. Nem o teste apresentado nem o manuscrito em si atendem aos requisitos para uma publicação científica aceitável. Além disso, não são mencionados sérios conflitos de interesse dos autores. Por fim, o curto período de tempo entre a submissão e a aceitação da publicação (24 horas) sugere que uma sistemática Processo de revisão por pares ou não foi executado aqui ou é de qualidade problemática. Oferecemos evidências convincentes de várias inadequações científicas, Falhas e defeitos.

Tendo em vista as lacunas científicas e metodológicas aqui apresentadas, estamos confiantes de que a equipe editorial da Eurovigilância não tem escolha a não ser publicar sacar.

RESUMO CATÁLOGO DE DEFEITOS ENCONTRADOS NO PAPEL

O Papel Corman-Drosten contém os seguintes erros específicos:

1. Não há nenhuma razão especificada para usar essas concentrações extremamente altas de primers neste protocolo. As concentrações descritas levam a um aumento da ligação inespecífica e amplificações do produto de PCR, o que torna o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para a detecção do vírus SARS-CoV-2.

2. Seis posições instáveis ​​não especificadas levam a uma enorme variabilidade nas implementações de laboratório do mundo real deste teste; a descrição confusa e inespecífica no artigo Corman-Drosten não é adequada como um protocolo de trabalho padrão, o que torna o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

3. O teste não consegue distinguir entre o vírus inteiro e os fragmentos virais. Portanto, o teste não pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para vírus intactos (infecciosos), o que significa que o teste é inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2 e permite tirar conclusões sobre a presença de um infecção.

4. Uma diferença de 10 ° C em relação à temperatura de recozimento Tm para o par de primer 1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) também torna o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

5. Um erro fatal é a falta de um valor Ct no qual uma amostra é considerada positiva e negativa. Este valor Ct também não é encontrado nos aplicativos subsequentes, o que torna o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para detectar o vírus SARS-CoV-2.

6. Os produtos de PCR não foram validados a nível molecular. Este fato torna o protocolo inutilizável como ferramenta diagnóstica específica para a detecção do vírus SARS-CoV-2.

7. O teste de PCR não contém um controle positivo claro para avaliar sua especificidade para SARS-CoV-2, nem um controle negativo para excluir a presença de outros coronavírus, o que torna o teste uma ferramenta diagnóstica específica para identificar SARS-CoV-2 O vírus não é adequado.

8. O design do teste no artigo de Corman-Drosten é tão vago e falho que pode-se seguir dezenas de direções diferentes; nada é padronizado e não há SOP. Isso questiona fortemente a validade científica do teste e o torna inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

9. Muito provavelmente, o artigo Corman-Drosten não foi revisado por pares, tornando o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

10. Encontramos graves conflitos de interesse em pelo menos quatro autores, além do fato de dois dos autores do artigo Corman-Drosten (Christian Drosten e Chantal Reusken) serem membros do conselho editorial do Eurosurveillance. Um conflito de interesses foi adicionado em 29 de julho de 2020 (Olfert Landt é Diretor Executivo da TIB-Molbiol; Marco Kaiser é Pesquisador Sênior da GenExpress e atua como consultor científico para TIB-Molbiol), que não foi declarado na versão original (e no PubMed -Version ainda está faltando); A TIB-Molbiol é a empresa que foi "a primeira" a produzir kits de PCR (Light Mix) com base no protocolo publicado no manuscrito Corman-Drosten e, em suas próprias palavras, vendeu esses kits de teste de PCR antes mesmo da publicação [20 ]; Além disso, Victor Corman & Christian Drosten não mencionou sua segunda afiliação: o laboratório de teste comercial "Labor Berlin". Ambos são responsáveis ​​pelo diagnóstico de vírus lá [21] e a empresa atua na área de testes de PCR em tempo real.

CONCLUSÃO

A decisão sobre quais protocolos de teste devem ser publicados e tornados geralmente acessíveis está nas mãos do Eurosurveillance. A decisão de reconhecer os erros que são evidentes no estudo Corman-Drosten tem a vantagem de que os custos e o sofrimento das pessoas serão bastante minimizados no futuro.
Não é do interesse do Eurosurveillance retirar este documento? Nossa conclusão é clara. Dadas todas as enormes falhas e falhas de projeto de protocolo de PCR descritas aqui, concluímos que, dentro da estrutura da integridade e responsabilidade científica, não há muita escolha.

[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detecção de novo coronavírus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real. Euro Surveill. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Comunicação por e-mail entre o Dr. Peter Borger e Dr. Adam Meijer: Material Suplementar

[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction - Positive Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, 21 de janeiro de 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
Arquivo: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics - COVID19-mortes em todo o mundo: https://bit.ly/3fndemJ
Arquivo: https://archive.is/PpqEE

[6] Testes de laboratório para Centro Técnico de Resposta de Emergência COVID-19, NIVD sob
China CDC 15 de março de 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Manual de PCR em tempo real Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf Nolan T, Huggett J, Sanchez E. Guia de boas práticas para a aplicação de PCR quantitativo (qPCR) Primeira edição 2013

[8] Trestan Pillonel et al, Carta ao editor: detecção de SARS-CoV-2 por RT-PCR em tempo real: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu e David WG Brown. "Técnicas de diagnóstico molecular." Medicina 38.10
(2009): 535-540.

[10] Wolfel et al., Avaliação virológica de pacientes hospitalizados com COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Ferramenta da Web do Thermofischer Primer Dimer: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library /thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

[12] Primer-BLAST, NCBI - Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. A sequência do genoma do coronavírus associado ao SARS. Science 300 (5624): 1399-1404.

[14] Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 isolado Wuhan-Hu-1, genoma completo: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. Um Coronavírus semelhante ao SARS era esperado, mas nada foi feito para ser preparado. Em J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared;  Arquivo: https://archive.is/i76Hu

[16] Processo de avaliação / revisão do papel do Eurosurveillance: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Recomendação oficial do protocolo e manuscrito Corman-Drosten pela OMS, publicado em 13 de janeiro de 2020 como versão 1.0 do documento: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -ensaio-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf; archive: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Recomendação oficial da OMS para o protocolo Corman / Drosten RT-qPCR, que deriva diretamente da publicação Eurosurveillance, versão do documento 2-1, publicada em
17th January 2020: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

[19] Conselho Editorial do Eurosurveillance, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf; Arquivo: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Instruções de uso LightMix SarbecoV E-gene mais EAV Control, TIB-Molbiol & Roche Molecular Solutions, 11 de janeiro de 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-gene_V200204_09164154001 (1 ) .pdf
Arquivo, carimbo de data / hora - 11 de janeiro de 2020: https://archive.is/Vulo5;  Arquivo: https://bit.ly/3fm9bXH [21] Christian Drosten & Victor Corman, responsáveis ​​pelo diagnóstico viral no Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/  Arquivo: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Culturas virais para avaliação de infecciosidade COVID-19. Revisão sistemática. Revisão sistemática doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932-XNUMX-XNUMX-XNUMX https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Kim et al., The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] Resposta do ECDC ao Dr. Peter Borger, 18 de novembro de 2020: Material Suplementar

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer e equipe, pesquisa e mesa Primer-BLAST